第四节 细胞培养的基本方法

一、原代培养

原代培养即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义：培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；原代培养过程中不分割培养物不等于不更换细胞培养基，也不等于不更换培养器皿。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成的。此细胞系一直沿用至今。

原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞将衰老死亡。但是有极少数的细胞能够继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40~50代，这种传代细胞叫作细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变，在培养过程中其特征始终保持。当细胞株传至50代以后就不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜细胞培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异较大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。

原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加细胞培养基、置于培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，必须保持培养物及生长环境的无菌。在多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（Monolayer culture），又叫贴壁培养（Adherent culture）。在少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性，可通过专门设备使细胞始终处于悬浮状态而在体外生长，这种形式称为悬浮培养（Suspension culture）。如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：取决于适当的生长基质表面；可降低接种后细胞培养基对细胞的浮力，如先补加少量细胞培养基，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；注意适当的细胞接种密度，一般105个/mL左右。

（一）原代培养原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置于适合的细胞培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称为原代培养。下面以原代培养胎鼠或新生鼠的肝细胞为例介绍原代培养细胞的操作步骤。

（二）原代培养操作步骤

1．胰酶消化法

（1）将孕鼠或新生小鼠通过断髓法处死，置75%酒精泡2~3s，注意浸泡时间不能过长，以免酒精从口和肛门浸入体内，再用碘酒消毒腹部，取胎鼠放入超净台内或将新生小鼠放在超净台内，解剖取肝脏，置于平皿中。

（2）用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物。

（3）用手术剪将肝脏剪成小块，1mm3左右，再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

（4）视组织块大小加入5~6倍的0.25%胰酶液，置于37℃的5%CO2培养箱中消化20~40min，每隔5min振荡1次，或用吸管吹打1次，使细胞充分分离。

（5）然后加入3~5mL细胞培养基以终止胰酶消化作用或加入胰酶抑制剂。

（6）静置5~10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

（7）用离心机以1000r/min离心10min，然后弃上清液。

（8）在沉淀中加入Hank's液5mL，冲散细胞，再离心1次，弃上清液。

（9）在沉淀中加入细胞培养基l~2mL（具体量由细胞量而定），血球计数板计数。

（10）将细胞数调整到5×105个/mL左右，转移至25mL细胞培养瓶中，置于37℃的5%CO2培养箱中培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同，如可用胶原酶或透明质酶等。

2．组织块直接培养法

自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将细胞培养基加至瓶中，培养基勿接触组织块。然后置于37℃的5%CO2培养箱中静置3~5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入细胞培养基中，但不要使组织漂起，在CO2培养箱中继续培养。

（三）操作注意事项

（1）操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭。试剂等瓶口也要擦拭。

（2）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

（3）点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

（4）在超净台中，组织细胞、细胞培养基等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

（5）操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

（6）不能用手接触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

（7）瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

（8）吸溶液的吸管等不能混用。

（9）凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞遮挡，以防止细菌落入。

二、传代培养

当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面因为细胞之间相互接触而发生接触性抑制，使细胞生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因为营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养（Subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。体外细胞培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养，可以相对地衡量培养物的培养年龄。

（一）传代培养原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

（二）传代培养操作步骤

（1）将长满细胞的培养瓶中原来的细胞培养基小心倒掉。

（2）加入0.5~1mL 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

（3）瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10mL培养液，终止消化。

观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间为1~3min。

（4）用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，将培养瓶塞好橡皮塞，置于37℃的5%CO2培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

三、细胞分离技术

（一）从原代组织中分离细胞

将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。

1．胰蛋白酶

（1）在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm的小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2~3次。

（2）将装有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶，100mg组织中加入1mL胰蛋白酶（Trypsin）。

（3）在4℃孵育6~18h，使胰蛋白酶尽可能渗透进去。

（4）移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃的5%CO2培养箱中孵育含残留胰蛋白酶的组织碎片20~30min。

（5）在组织碎片中加入热的完全细胞培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清细胞培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

（6）通过100~200mm无菌不锈钢丝网过滤细胞悬液，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。

2．胶原酶

（1）用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hank's平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

（2）加入胶原酶（Collagenase）。胶原酶50~200单位/mL，溶解在HBSS中。

（3）在37℃的5%CO2培养箱中孵育4~18h。加入3mmol/L CaCl2增加解离效率。

（4）通过100~200mm无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

（5）通过离心，在平衡盐溶液中清洗悬液几次。

（6）再一次在细胞培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

3．Dispase

（1）用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

（2）加入Dispase（0.6~2.4单位/mL溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在37℃的5%CO2培养箱中孵育20min到几个小时。

（3）通过100~200mm无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。

（4）如果需要进一步解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。通过离心，在平衡盐溶液中清洗悬液几次。再一次在细胞培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

（二）从原培养容器中分离细胞

下面简单介绍从原培养容器基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般操作步骤。再次培养时检测细胞的活性，细胞的存活率应该超过90%，对于无血清细胞培养基，应降低胰蛋白酶使用量。

（1）移弃使用过的细胞培养基。

（2）使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA溶液清洗细胞。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1~2min清洗细胞层，然后去除清洗液。

（3）以2~3mL/25cm2的量，加入适合的分离液到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃的5%CO2培养箱中孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。一般在5~15min内细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

（4）当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全细胞培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打，分散细胞。进行细胞计数并再次培养细胞。

（5）对于无血清细胞培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/mL胰蛋白酶抑制剂加到胰蛋白酶中，抑制胰蛋白酶活性。

四、细胞的冻存与复苏

（一）细胞的冻存

细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。细胞的冻存常采用深低温保存法，温度要求在－196~－70℃。

1．细胞冻存的原理

细胞深低温保存法的基本原理：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。细胞低温保存的关键在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

2．常用于细胞冻存的细胞培养基

对于包含血清的细胞培养基，一些普通的细胞培养基成分可能如下：包含10%甘油的完全细胞培养基；包含10%DMSO的完全细胞培养基；50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜细胞培养基；或50%细胞条件培养基和50%含有10%DMSO的新鲜细胞培养基。

对于无血清细胞培养基，一些普通的细胞培养基成分可能是：50%细胞条件无血清细胞培养基和50%包含有7.5%DMSO的新鲜的无血清细胞培养基；或包含有7.5%DMSO和10%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）的新鲜无血清细胞培养基。

3．细胞冻存的方法

细胞冻存的基本方法：预先配制冻存液，含20%血清细胞培养基（70%的完全细胞培养基+20%FBS+10%DMSO）, DMSO要慢慢滴加，边滴边摇；取对数生长期细胞，胰酶消化，离心，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106~5×106个/mL）；加入1mL细胞悬液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期；4℃条件下可保存40min至1h,－20℃条件下可保存40min至1h,－70℃过夜，随后放入液氮中保存。悬浮细胞和贴壁细胞的冻存方法有些不同，下面简单介绍悬浮细胞和贴壁细胞的冻存方法。

（1）悬浮细胞。

①要冻存的细胞应该是处于对数生长期。首先计数将要冻存的活细胞。然后以200~400g/min离心5min沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

②以1×107~5×107个/mL密度，在含有血清的冷冻细胞培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107~1×107个/mL在无血清细胞培养基中，再次悬浮细胞。

③分装进冻存管，即加入1mL细胞悬液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

④将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5min内开始冷冻步骤。细胞以1℃/min进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到－90~－70℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

（2）贴壁细胞。

①使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，将对细胞的损伤减少到最小。

②在完全生长细胞培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

③以大约200g/min离心5min沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

④以1×106~5×106个/mL密度，在冻存液中悬浮细胞。

⑤分装进冻存管，即加入1mL细胞悬液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

⑥将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5min内开始冷冻步骤。细胞以1℃/min进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到－90~－70℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

（二）冻存细胞的复苏

冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长细胞培养基中。目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存细胞培养基，然后加入完全生长细胞培养基中。

1．直接铺板方法

（1）从液氮中取出储存细胞的冷冻管，迅速投入37~42℃水浴中，轻微摇动，注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管。1~1.5min，液体全部融化后，取出冷冻管，在冷冻管表面喷洒酒精后放到超净工作台里。

（2）直接用完全生长细胞培养基铺板细胞。1mL冻存细胞使用10~20mL完全生长细胞培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105个/mL。

（3）标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，培养细胞12~24h，去除冻存剂，更换新鲜的完全生长细胞培养基。

（4）根据细胞增长速度2~3d更换一次细胞培养基。

2．离心方法

（1）从液氮中取出储存细胞的冷冻管，迅速投入37~42℃水浴中，轻微摇动，注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管。1~1.5min，液体全部融化后，取出冷冻管，在冷冻管表面喷洒酒精后放到超净工作台里。

（2）把上述细胞悬液吸到装10mL细胞培养基的15mL的离心管中，注意要用细胞培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来，轻轻混匀。

（3）以大约80g/min离心2~3min，把上清液倒掉，加1mL细胞培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10mL新鲜细胞培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

（4）在完全生长细胞培养基中轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105个/mL。

（5）标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后更换新鲜的完全生长细胞培养基。

（6）根据细胞增长速度，2~3d更换一次细胞培养基。

（三）细胞的分化、衰老与死亡

1．细胞的分化

一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞，其形态结构、代谢、行为、功能等各不相同。通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化（Cell differentiation）。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段，如人体血细胞的产生和分化。这个过程在人的一生中一直持续着。

由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。

2．细胞的衰老

细胞衰老（Cell aging）过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成分出现；同时细胞核、线粒体、膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。体外细胞培养成纤维细胞实验证明，来自胎儿传代50次后衰老死亡，来自成人传代20次后衰老死亡，来自小鼠传代14~28次后衰老死亡，来自乌龟传代90~125次后衰老死亡。

细胞衰老的原因和机制尚不明确，有关细胞衰老的机制有多种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。

3．细胞的死亡

细胞的死亡（Cell death）是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种：细胞坏死（Cell necrosis）、细胞凋亡（Cell apoptosis）和细胞毒性（Cytotoxicity）。在多细胞生物的生命活动中，一部分细胞因为环境因素的突然变化或病原物的入侵而死去，称为细胞的病理死亡或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡；细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其他两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的、有序的死亡。凋亡（Apoptosis）则是程序性的、正常的细胞死亡，是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程，无论从形态学、生物学还是生化的特征来说，都有明显的区别。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一个被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果很严重：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征、重症肝炎与退行性神经疾病等。

4．细胞凋亡与坏死的区别

（1）坏死。

坏死具有以下特征：①形态学特征：膜完整性丧失，胞浆和线粒体膨胀，全细胞裂解。②生化特征：非能量依赖性的离子内环境失调，一般在4℃也可以发生，是一个被动过程；随机消化DNA，电泳时显示为DNA弥散状态、DNA断裂。③生理学特征：坏死影响群组细胞，由非生理学因素，如补体攻击、代谢中毒、缺氧等引起；被巨噬细胞吞噬，周围有明显的炎症反应。

（2）凋亡。

凋亡具有以下特征：①形态学特征：胞膜出芽，但保持完整，染色体聚集在核膜周边，胞浆收缩、细胞核凝集，最后细胞分裂为凋亡小体，Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加。②生化特征：凋亡是ATP依赖性的，一般在4℃不能发生，是一个主动过程；以核小体为单位剪切DNA，电泳时显示为DNA ladder、DNA断裂；线粒体释放多种因子至胞浆中，如细胞色素C、AIF;Caspases级联活化；膜对称性改变，如PS外翻。③生理学特征：凋亡只影响单个细胞，由生理学刺激诱导，如生长因子缺乏、激素环境改变等；被临近细胞和巨噬细胞吞噬，无炎症反应。

五、细胞计数及活力测定

（一）基本原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫作细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

一般常用台盼蓝染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

（二）仪器、用品与试剂

（1）仪器与用品：普通显微镜、细胞计数板、试管、吸管、酶标仪或分光光度计。

（2）试剂：0.4%台盼蓝，0.5%4℃四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）、酸化异丙醇。

（3）材料：细胞悬液。

（三）操作步骤

1．细胞计数

（1）将细胞计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

（2）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

（3）静置3min。

（4）镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计数左侧和上方的细胞，右侧和下方的细胞不计数（图1-2、图1-3）。然后按下式计算：

细胞数/mL＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

2．细胞活力

（1）取0.5mL细胞悬液加入试管中。

（2）再加入0.5mL 0.4%台盼蓝染液，染色2~3min。

（3）吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

（4）镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

3．MTT法测细胞相对数和相对活力

（1）测定原理。

MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，又称MTT比色法。测定原理：外源性的MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶甲臜产物（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞则无这种能力。DMSO能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比。结晶溶解后用酶标仪在570nm或720nm波长处测定其光密度（OD）值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，其颜色越深，OD值就越高，反映活细胞的数量就越多，因而可较准确地反映试验板各孔中活细胞的相对量，可间接反映细胞增殖状况。MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

（2）贴壁细胞操作步骤。

①取对数生长期的细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μL，置于37℃, 5%CO2培养箱中培养，培养24h后，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，按实验设计分组对细胞进行处理，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，一般设5~7个浓度梯度，设3~5个复孔，建议设5个，否则难以反映真实情况。同时设置调零孔，可用细胞培养基、MTT、DMSO；对照孔，可用细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO。

②处理后将细胞置于5%CO2, 37℃孵育16~48h，然后每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，放入5%CO2培养箱中继续孵育4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS缓冲液冲2~3次，再加入含MTT的培养液。

③终止培养，小心吸出96孔板孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。

④使用酶标仪测定570nm处的吸光度值（OD），计算细胞相对存活率。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。细胞相对存活率（%）＝（OD样品-OD本底）/（OD对照-OD本底）×100。

（3）悬浮细胞操作步骤。

①取对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度1×106个/mL，按次序将1640（无血清）细胞培养基40μL; Actinomycin D 10μL，用培养液稀释l μg/mL；需检测物10μL；细胞悬液50μL（即5×104个/孔），共100μL加入96孔板（边缘孔用无菌水填充）。按实验设计分组对细胞进行处理，一般设5~7个浓度梯度，设3~5个复孔。同时设置调零孔，可用细胞培养基、MTT、DMSO；对照孔，可用细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO。

②处理后将细胞置于5%CO2, 37℃孵育16~48h，倒置显微镜下观察。

③每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h。悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可直接酶联免疫检测仪在570nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）（630nm校准）。

④用离心机以1000r/min离心10min，小心吸掉上清，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪在570nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。

4．XTT法

（1）测定原理：XTT（四唑鎓盐）是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，XTT作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。当XTT与电子耦合剂（如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。此法的优点是使用方便；检测快速；灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；重复性优于MTT。此法的缺点是XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

（2）操作步骤：

①首先配置6.6mmol/L XTT溶液和220mmol/L 1－甲氧基－5－甲基酚嗪硫酸甲酯盐（1-Methoxy PMS）溶液。临用时将XTT与PMS按1∶1混合，形成XTT/PMS。

②取对数生长期的细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μL，置于37℃, 5%CO2培养箱中培养，培养24h后，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，按实验设计分组对细胞进行处理，每组设3个平行孔。

③处理24h后每孔加入XTT/PMS溶液20μL，放入5%CO2培养箱中继续孵育2h。

④使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD），参考波长为655nm，计算细胞相对存活率。

5．WST-1法

（1）测定原理：WST-1是被开发的第一个水溶性四唑盐试剂，是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、高稳定性且无放射性的比色检测法。ST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：①MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的Formazan不是水溶性的，需要由特定的溶解液溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的Formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤；②WST-1产生的Formazan比XTT和MTS产生的Formazan更易溶解；③WST-1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定；④WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高，可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等；⑤WST-1使用时无须同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成；⑥不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤溶解Formazan; ⑦WST-1对细胞无明显毒性；⑧加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

（2）操作步骤：

①取对数生长期的细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，按实验设计分组对细胞进行处理，每组设3个平行孔。

②处理24h后每孔加入10μL四唑盐工作液，放入5%CO2培养箱中继续孵育1~4h。

③使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD），计算细胞相对存活率。

6．CCK-8法

（1）测定原理：

CCK-8是近年新开发的一种更新的水溶性四唑盐检测，又称为WST-8法，其原理与WST-1类似：在电子载体1－甲氧基－5－甲基酚嗪硫酸甲酯盐（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色Formazan。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数量范围内，甲臜形成的量与细胞数呈正比。

（2）操作步骤：

①取对数生长期的细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，按实验设计分组对细胞进行处理，每组设3个平行孔。

②处理24h后，每孔加入10μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）放入5%CO2培养箱中继续孵育1~4h。

③使用酶标仪测定450nm处的吸光度值（OD），参考波长为655nm，计算细胞相对存活率。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1mol/L的HCl溶液或者1%（W∶V）十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfat, SDS）溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24h内测定，吸光度不会发生变化。

六、细胞的分裂指数

（一）原理

体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

（二）仪器、用品与试剂

（1）仪器与用品：CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片、吸管。

（2）试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液。

（三）操作步骤

（1）消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

（2）置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h，使细胞长在盖片上。

（3）48h后，取出盖玻片，按下列顺序操作：先用PBS缓冲液漂洗3min，然后放入甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定液中固定30min，再加Giemsa液染色10min，最后用自来水冲洗。

（4）盖玻片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

（5）计算：分裂指数（%）＝分裂细胞数/总细胞数×100。

七、细胞周期的测定

（一）测定原理

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反映了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU（5－溴脱氧尿嘧啶核苷）加入细胞培养基后，可作为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

（二）仪器、用品与试剂

（1）仪器、用品：同常规细胞培养。

（2）试剂：BrdU（1.0mg/mL）、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、秋水仙素、2×SSC液。

（三）操作步骤

（1）细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/mL。

（2）44h后加秋水仙素，使每1mL中含0.1μg。

（3）48h后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

（4）常规染色体制片。

（5）染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC液，距紫外灯管6cm处照射3min。

（6）弃去2×SSC液，流水冲洗。

（7）Giemsa液染色10min，流水冲洗，晾干。

（8）镜检100个分裂相，计第一、第二、第三、第四细胞期分裂指数。

（9）计算：细胞周期（Tc）＝48/[（M1+2M2+3M3+4M4）/100]（h）。

八、细胞转移相关研究方法

（一）划痕

肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力，本方法借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。

操作步骤

（1）将细胞密度为5×105~10×105个/mL的细胞铺于24孔板（每孔500μL）上，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640细胞培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养16~24h，使形成单层细胞。

（2）用10μL移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS缓冲液清洗3次，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

（3）孵育24h后，换成含10%胎牛血清的RMPI 1640细胞培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h。

（4）24h后，观察并拍照：吸去培养液，用PBS缓冲液清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

（二）细胞黏附

细胞黏附实验通常分为两类，即细胞与细胞黏附、细胞与基质黏附。机体内许多细胞，如上皮细胞固定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞活跃运动，就需要不断调节细胞黏附性。细胞黏附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞相互识别及黏附机制发生了改变。

操作步骤如下。

（1）先用10μg/mL的纤连蛋白（Fibronectin, FN）预铺96孔板，70μL/孔，4℃过夜后，用PBS缓冲液洗3次，再用1%BSA于37℃封闭1h后，用PBS缓冲液洗3次。

（2）将待检测细胞培养至对数生长期，用酶消化细胞，用无血清细胞培养基悬浮细胞，调整浓度为5×105个/mL分别接种于预铺FN的96孔板中，每孔5000个细胞，每组设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

（3）孵育1h后，PBS缓冲液洗去未黏附的细胞。

（4）检测方法：

检测方法1：用3.5%戊二醛于4℃固定0.5h, PBS缓冲液洗3次；0.1%的结晶紫染色，室温静止0.5h，再用PBS缓冲液洗3次，每孔加入100μL 10%的乙酸，5~10min后，用酶标仪检测595nm处的吸光度值，用以表示黏附细胞的多少。

检测方法2：按照每孔加入100μL甲醇，固定15min，每孔再加入100μL吉姆萨染液，染色15min后，用PBS缓冲液洗去染液，在倒置显微镜下随机取5个视野计数黏附细胞数量并拍照，统计结果。

检测方法3：用MTT法或CCK-8检测细胞量。

（三）Transwell迁移

细胞迁移实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

操作步骤

（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber均放在37℃恒温水浴箱中温育。

（2）将待检测细胞培养至对数生长期，用酶消化细胞，然后用PBS缓冲液和无血清细胞培养基先后洗涤细胞1次，再用无血清细胞培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105个/mL。

（3）在下室（即24孔板底部）加入600~800μL含10%血清的细胞培养基，上室加入100~150μL细胞悬液，继续在37℃、5%CO2培养箱中培养24h。

（4）24h后，用镊子小心取出Chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μL甲醇的孔中，室温固定30min。

（5）固定后，取出Chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中，室温染色15~30min。

（6）染色后，轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出Chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上，用中性树胶封片。

（7）在显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

（四）Transwell侵袭

Transwell侵袭是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

操作步骤：

（1）基质胶准备：将冻存于－80℃冰箱的BD Matrigel于4℃下过夜（24h），变成液态。取300μL无血清细胞培养基，加入60μL（或50μg/每室）Matrigel, 4℃混合均匀，加入上室各100μL（3个室），置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4~5h。当出现白色层时，说明已经变为固态。

（2）将待检测细胞培养至对数生长期，用酶消化细胞，再用无血清细胞培养基洗细胞3次，并计数，配成细胞悬液。

（3）用无血清细胞培养基洗Matrigel 1次，每孔加入100μL细胞悬液。下腔室中加入500μL含有20%FBS条件细胞培养基。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育20~24h。

（4）孵育后，取出Transwell用PBS缓冲液冲洗2次，再用5%戊二醛于4℃下固定。

（5）固定后，加入0.1%结晶紫或Giemsa于室温下染色5~10min，再用PBS缓冲液冲洗2次，用棉球擦去上表面细胞。

（6）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

九、细胞培养的注意事项

（1）实验进行前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30~60min灭菌，并用70%乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10min后，才可以开始实验操作。

（2）无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流的流通。实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘的非无菌区域操作。

（3）开紫外线照射操作台的同时将细胞培养基、酶、缓冲液等移到室外让它自然升温。40min后，温度就升上来了，或将其放到37℃水浴锅里加热。但一定要注意水浴锅的卫生，如常年不清洗，瓶身外面容易吸附大量细菌。因此用时也一定要勤换水，从水浴锅拿出后，最好吸干瓶身上面的水。

（4）小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

（5）每次操作只处理一株细胞株，且即使细胞培养基相同亦不共享细胞培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10min以上后，再进行下一个细胞株的操作。

（6）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣及手套后才能进行实验。对于来自人类或病毒感染的细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台。在操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头的伤害等。

（7）定期检测下列项目：二氧化碳钢瓶的CO2压力；二氧化碳培养箱的CO2浓度、温度及水盘是否有污染，水盘的水用无菌水，每周更换；无菌操作台内的空气流压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜；水槽可添加消毒剂，定期更换水槽的水。

（8）粉末细胞培养基配制：加血清后，放置时间不宜过长，一般在4℃存放尽量不要超过1个月，如在－20℃存放时间可长一些，但最好不要超过3~4个月。