- 全国临床检验操作规程（第4版）
- 尚红 王毓三 申子瑜主编
- 3103字
- 2021-04-16 17:04:52
第七节 血清无机磷测定
磷是机体重要的组成部分。血清中磷的浓度变化很大，与年龄、饮食、性别有一定的关系。血浆中的磷通常是指无机磷的浓度。血磷浓度有昼夜变化的规律，凌晨开始下降，到上午10时左右最低，随后逐渐上升后半夜可达到高峰值。
血清无机磷( phosphorus，P)测定方法有硫酸亚铁磷钼蓝比色法、硫酸亚铁铵还原直接测定法、紫外分光光度法、染料结合法、黄嘌呤氧化酶法、CV-多元络合超微量测定法、放射性核素稀释质谱法、原子吸收分光光度法等。决定性方法是放射性核素稀释质谱法。WHO推荐使用比色法，其中紫外分光光度法简便、快速、稳定、易于自动化，但缺点是受溶血、黄疸、脂血的干扰较大。CV-多元络合体系光度法直接超微量测定，灵敏度较高。酶法为磷检测的发展方向，特异性较高，线性范围广，不易受常规干扰物影响。
目前我国卫生部临床检验中心推荐的常规方法是以硫酸亚铁或米吐尔(对甲氨基酚硫酸盐)作还原剂的还原钼蓝法。在CAP的调查中，大约2/3实验室采用340nm直接紫外分光光度法测定，只有1/3实验室采用还原成钼蓝的比色法测定。
一、检测方法
(一)紫外分光光度法 【原理】
在酸性条件下，样品中无机磷与钼酸铵作用生成磷钼酸盐复合物。这种复合物在340nm波长处有吸光峰，吸光度的变化与无机磷的浓度成正比，与同样处理的标准品比较，可求得样品中无机磷的含量。
1.手工检测 【试剂】 ( 1) 0.15mmol/L钼酸铵溶液:
钼酸铵111.2mg、NaN 350mg至小烧杯中，加50ml蒸馏水溶解并转入100ml容量瓶中，加Triton X-100 0.2ml，加水至刻度。
( 2) 2%硫酸:
准确吸取浓硫酸2ml加至98ml水中，混匀即可。
( 3)应用液:
应用前，根据当日测定的标本数量，取适量的上述“1”液和“2”液进行等量混合。
( 4)磷标准液:
1.292mmol/L。
【操作】
取试管3支，标明测定管、标准管和空白管，然后按表2-3-5操作。
表2-3-5 无机磷紫外分光光度法测定操作步骤
混匀，室温放置5分钟后用分光光度计，在波长340nm，比色杯光径10mm，用空白管调零，读取各管的吸光度。
【结果计算】
度( mmol/L)
2.自动化分析仪检测 【试剂】 ( 1) R1
硫酸 0.36mmol/L
表面活性剂
( 2) R2
钼酸铵 3.5mmol/L
硫酸 0.36mol/L
氯化钠 150mmol/L
【操作】
血清样品与试剂R1混合，温育，加入试剂R2，温育一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
方 法:紫外分光光度法/终点法
样本/试剂: 2μl/90μl/45μl
主波长: 340nm 反应温度: 37℃
副波长: 800nm 反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和血清样品分析。
【结果计算】
测定管吸光度为A 1，空白管吸光度为A 2。
ΔA = A 1－A 2。
全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算，并产生最终报告结果。
3.注意事项 ( 1)检测波长要求:
凡带有紫外波长325nm或340nm的分光光度计均可应用。340nm测得的吸光度是325nm (吸收峰在325nm)的82%。
( 2)本反应在:
5～120分钟内显色稳定，3小时后，标准管吸光度无改变;而测定管吸光度随时间的延长而上升，这可能与血清中含有极微量的还原性物质有关。
( 3)表面活性剂要求:
Tween-80、Tween-20 ( 0.4%V/V)和Triton X-100 ( 0.2%V/V)三种表面活性剂均适用于本法，所测结果基本相同，因此可选用其中的一种。吐温浓度以0.4%为佳，浓度太大，试剂颜色加深，吸光度增高。浓度太低，易产生混浊。
( 4)干扰因素:
黄疸和脂血标本应做标本空白，溶血标本会使结果偏高，不宜采用。单克隆免疫球蛋白含量高的标本采用此法测定时，因其结合磷酸盐，测定结果假性升高。
( 5)标本稳定性:
标本室温放置30～45分钟后离心分离血浆或血清。从接收标本到上机检测的最长时间限制是4小时，15～30℃的环境下不应超过8小时。如无法在4小时内完成，血清或血浆应该被保存在2～8℃。如无法在48小时内完成，应保存在－20℃，但不可反复冻融。
( 6)尿液标本要求:
采集尿液样本时，整个收集的过程应该在2小时内完成。若是检测24小时尿液的样本，保存样本的容器应该放置在冰箱或是在保存的过程中持续冰浴。假如需要防腐剂，应当在尿液收集前事先加入容器中。
( 7)线性范围:
0.323～3.876mmol/L ( 1～9mg/dl)。
(二)米吐尔直接显色法 【原理】
利用无机磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成磷钼酸铵复合物，用还原剂对甲氨基酚硫酸盐(米吐尔)还原生成钼蓝。在试剂中加入Tween-80以抑制蛋白质的干扰。
1.手工检测 【试剂】 ( 1) R1钼酸铵溶液:
在50ml去离子水中加浓硫酸3.3ml，再加钼酸铵0.2g，溶解后加Tween-80 0.5ml，最后去离子水至100ml。
( 2) R2对甲氨基酚硫酸盐(米吐尔)溶液:
称取对甲氨基酚硫酸盐2g，溶于80ml去离子水中，加无水硫酸钠5g，最后加去离子水至100ml。
( 3) R3显色应用液:
取1液10ml，2液1.1ml混合即可应用。
( 4) R4磷标准液:配制方法同前法。
【操作】
取试管3支，标明测定管、标准管和空白管，然后按表2-3-6操作。
表2-3-6 无机磷米吐尔直接显色法测定操作步骤
混匀后置37℃水浴10分钟，取出，用分光光度计，在650nm波长，以空白管调零，10mm光径比色杯进行比色，读取各管的吸光度。
【结果计算】
2.自动化分析仪检测 【试剂】
( 1) R1钼酸铵溶液:配制方法同前法。
( 2) R2对甲氨基酚硫酸盐(米吐尔)溶液:配制方法同前法。
( 3) R3磷标准液:配制方法同前法。
【操作】
血清样品与试剂R1混合，温育，加入试剂R2，温育一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
方法:米吐尔直接显色法/终点法
样本/试剂: 4μl/180μl/90μl
主波长: 650nm 反应温度: 37℃
副波长: 700nm 反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和血清样品分析。
【结果计算】
测定管吸光度为A 1，空白管吸光度为A 2。
ΔA = A 1－A 2。
全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算，并产生最终报告结果。
3.注意事项 ( 1)白球蛋白比值倒置标本的处理:
本法对血清白球蛋白比值倒置的标本易产生混浊，解决办法是用30g/L三氯醋酸去蛋白处理。方法如下:取血清0.2ml，加30g/L三氯醋酸1.8ml，充分混匀后离心，取上清液1.0ml。磷标准液同样进行处理，然后加显色液4.0ml，混匀后进行比色。
( 2)试剂要求:
米吐尔试剂应少量配制，放置时间不宜太长，否则正常血清有时也会产生轻度混浊。
二、参考区间
成人( 20～79岁)血清无机磷: 0.85～1.51mmol/L (此数据引自WS/T 404.6《临床常用生化检验项目参考区间》)。
成人尿液无机磷: 32.3～38.4mmol/24h ( 1.0～ 1.5g/24h) (此数据引自孙荣武，王鸿利《临床实验诊断学》)。
儿童血清无机磷: 1.45～2.10mmol/L ( 4.5～6.5mg/dl) (此数据引自孙荣武，王鸿利《临床实验诊断学》)。
单位换算系数:血清无机磷( mg/dl) =血清无机磷( mmol/L)÷0.323。
三、临床意义
1.血清无机磷异常
( 1)增高:①甲状旁腺功能减退。本病常因手术不慎伤及甲状旁腺或其血管，使激素分泌减少，肾小管对磷的重吸收增强使血清磷升高。假性甲状旁腺功能减退也伴有血清磷增高。②肾功能不全或衰竭、尿毒症或肾炎晚期，磷酸盐排出障碍使血清磷滞留。③维生素D过多，促进肠道钙磷吸收，血清钙磷升高。④多发性骨髓瘤、骨质疏松、骨转移瘤、骨折愈合期。
( 2)降低:①甲状旁腺功能亢进时，肾小管重吸收磷受抑制，尿磷排泄增多，导致血磷降低。②佝偻病或软骨病伴有继发性甲状旁腺增生，尿磷排泄增多导致血磷降低。③糖利用增加:连续静脉输入葡萄糖并同时输入胰岛素，或胰腺瘤伴有胰岛素过多症，使糖利用增加，消耗大量的无机磷酸盐。④肾小管变性病变，使肾小管重吸收磷障碍，血磷偏低。⑤乳糜泻时肠内大量的脂肪存在，抑制磷吸收。
2.尿磷异常
临床检测尿磷浓度主要用于钙磷代谢、骨病评价及骨病治疗检测。
( 1)尿磷增加:见于甲状旁腺功能亢进、代谢性酸中毒、痛风、软骨病、肾小管疾病(肾小管酸中毒、Fanconi综合征)、抗维生素D佝偻病、甲状腺功能亢进等。
( 2)尿磷减少:见于甲状旁腺功能减退、佝偻病、肾功能不全、维生素D缺乏时摄取高钙膳食、妊娠、哺乳期的妇女。
3.尿磷减少、血磷增加，反映肾小球滤过率降低;尿磷增加、血磷减少，反映肾小管功能障碍。